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博士論文 / Slc:WistarクローズドコロニーラットおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に関する研究 Study of genetic profiling of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats

著者

書誌事項

タイトル

Slc:WistarクローズドコロニーラットおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に関する研究

タイトル別名

Study of genetic profiling of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats

著者名

中西聡

学位授与大学

麻布大学 (大学ID:2141) (CAT機関ID:KI002792)

取得学位

博士(獣医学)

学位授与番号

乙第434号

学位授与年月日

2017-12-18

注記・抄録

実験動物としてのラットは、ドブネズミ(学名Rattus norvegicus, 英名Norway rat)を馴化したものであり、同じクマネズミ属に含まれるクマネズミ(学名Rattus rattus, 英名black rat)とは異なる。ラットは、栄養、代謝、および生理学上の特徴がヒトと類似している点が多いことから、医学、薬理学、毒性学、生物学、栄養学、行動、心理学、免疫学、あるいは腫瘍学などの幅広い分野での実験動物および医薬品等の毒性試験や安全性試験に広く使用されている。遺伝的統御の違いから、近交系(Inbred strains)とクローズドコロニー(Outbred ratsとも言う)に大別される。近交系とは兄妹交配を20代以上継続し、ほぼすべての遺伝子座がホモ型に固定した遺伝的に均一な動物である。現在、近交系ラットは世界中で300系統以上が樹立されている。一方、クローズドコロニーは、5年以上にわたって他の群からの遺伝子の移入がなく、一定の集団のみで繁殖を継続するので、一般的に、個体ごとに遺伝子組成が異なる。 実験用ラットは、これまでに選抜育種、他系統との交雑や遺伝子改変技術の進歩によって、研究目的に応じて様々なラット系統が開発されてきた。研究目的にあった遺伝的特徴を持ったラットを研究に用いることが求められるので、ジェノタイピングにより遺伝的プロファイル解析を行い、その遺伝的な特性を明らかにすることが重要である。その為には、正確、迅速、簡便で効率的なジェノタイピング法の確立や遺伝多型マーカーを用いた遺伝的モニタリングシステムの構築は必須である。本研究の目的は、遺伝的プロファイル解析に有用な遺伝多型マーカーを用いてSlc:WistarクローズドコロニーラットおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的特徴を明らかすることであり、さらに、遺伝的品質管理に適した迅速で簡便なジェノタイピング法についての技術開発を行うことである。 第1章では、第3世代の遺伝多型マーカーであるSSLPマーカーをクローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に適応し、その有用性を検討した。クローズドコロニーラットであるSlc:Wistarラットの様々な表現形質が、F344近交系ラットと類似している問題について、ゲノム全域に散在する27個のSSLPマーカーを選定してSlc:WistarラットとF344ラットの遺伝的プロファイル解析を行った。本章で選定した27個のSSLPマーカーは近交系ラットのみならず、クローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に有効であることが示された。Slc:Wistarラットは、85%の遺伝子座が特定の対立遺伝子に固定しており、遺伝的多様性が低いことが示された。そして、それらの遺伝子型はF344ラットの遺伝子型と同一であった。以上の結果から、Slc: Wistar ラットは遺伝的多様性が著しく低く、Slc:WistarラットとF344近交系ラットの遺伝的プロファイルには類似性が高いことが明らかになった。 第2章では、東京医科大学で維持されていたZFラットコロニーを由来とする肥満を示すSlc:ZFラットコロニーと肥満、糖尿病を示すHos:ZFDMラットコロニーの表現型の相違を探るため遺伝的プロファイル解析を行った。はじめにSlc:ZFラットとHos:ZFDM ラットの遺伝的プロファイルを作成するために、第1章で選定した27個のSSLPマーカーを用いてゲノムDNA抽出を必要としない迅速で簡易なジェノタイピングシステムにて遺伝的プロファイルを作成した。次に、これら2つのラットコロニーの遺伝的特徴を明らかにするために、東京医科大学で維持されていたZFラットコロニーを由来とするKZFラット系統とKZCラット系統の遺伝的プロファイルを比較した。最後に、染色体上の分散状態を考慮してY染色体を除く全ての常染色体とX染色体上に各3~4個のSSLPマーカーを選択し、合計72個のSSLPマーカーを加えてより詳細な遺伝的プロファイル解析を行った。Slc:ZFラットとHos:ZFDMラットの2つのクローズドコロニーラットは、共に約90%の遺伝子座が特定の対立遺伝子に固定していた。また、両コロニーは同じコロニーを起源とするにもかかわらず異なる対立遺伝子を有する遺伝子座が約30%であり、これが、2つのクローズドコロニーラットの表現型の相違の基盤となっていると考えられた。本研究で行った、Slc:ZFラットとHos:ZFDMラットの遺伝的プロファイル解析は、2型糖尿病の発症と繁殖性に関連する遺伝的要因を明らかにするのに貢献できると結論づけられた。 第3章では、第1章と第2章で実施した遺伝的プロファイル解析など生体サンプルの遺伝子型判定を迅速かつ簡便に行う方法の開発とその応用について検討を行った。本章では、PCR阻害物質を中和するPCR緩衝液Ampdirect Plusとflinders technology associates(FTA)カードを組み合わせたゲノムDNA抽出を必要としない迅速で簡易なジェノタイピング法であるAmpirect Plus-FTA(Amp-FTA)法の開発を試みた。また、外来性遺伝子の検出、第3世代の遺伝多型マーカーであるSSLPマーカーと第4世代の遺伝多型マーカーであるSNPsを用いて内在性遺伝子の検出について検討を行った。さらに、試料の採材方法や室温にて長期保存した場合のPCRに及ぼす影響についても検討を行った。Amp-FTA法では、FTAカードに採取したごく少量の血液を未精製のままディスクとして打ち抜きPCRテンプレートとして使ってPCR増幅を行うことが可能である。PCR産物は、直接制限酵素、PCRダイレクトシークエンスおよび定量PCRに応用することができた。さらに、FTAカードに採取した血液を10年間室温で保存しても再現性の高いジェノタイピングが可能である。また、マウスやラットにおいて非侵襲的な口腔スワブ由来のサンプルにおいてもPCR増幅が可能である。Amp-FTA法によるジェノタイピングは、正確、迅速、簡易、高い再現性に加えて、微生物汚染の軽減、作業の安全性向上にも繋がり、ラットの遺伝的な品質管理において優れている。さらに、Amp-FTA法によるジェノタイピングは、医学、獣医学、農学(食品、畜産、畜産、園芸等)など、PCRによるジェノタイピングを行う領域すべてにおいて応用可能であると考えられる。 本研究では、遺伝的プロファイル解析に有用な遺伝多型マーカーを用いてSlc:WistarクローズドコロニーおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的特徴を明らかにし、さらに、遺伝的プロファイル解析など生体サンプルの遺伝子型判定を迅速かつ簡便に行う方法の開発とその応用について具体的な研究成果を示した。研究目的にあった遺伝的特徴を持ったラットを研究に用いることの重要性を示し、今後、さらに実験動物としてのラットを用いた研究の発展に寄与するものであると考えられる。

The laboratory rat (Rattus norvegicus) is an indispensable tool for developing experimental medicines and drugs. The rat plays an important role as laboratory animal in various reach fields, such as physiology, pharmacology, neurosciences, genetics, and medical sciences. It is used extensively as a model organism for studying normal and disease processes in humans. This is primarily due to our extensive knowledge of rat physiology and more than 300 rat models that mimic human diseases. Rats are key tools for drug efficacy and toxicity prior to performing human clinical trials. It is essential to establish a genetic control system, which enables fast and reliable genotyping methods to ensure good colony management. Additionally, it is important to know the genetic characteristics of the rats to use in experimental studies so that the most suitable rats for particular experimental purpose can be selected. The aim of this study was to clarify the genetic characteristics of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats and to develop a simple genotyping method for the genetic quality control.Chapter 1 Although Slc:Wistar rats are widely used in biomedical research as outbred rats, close similarities in growth curve, survival rate, immunological, and biochemical phenotypes between the Slc:Wistar rats and F344 inbred rats have been reported. In addition, we previously found that the nine genetic variations were fixed in the Slc:Wistar rats and genotypes of them were identical with those of F344 rats. In this study, we examined the genetic characteristics of the Slc:Wistar rats with 27 SSLP markers and compared it with those of Wistar stocks available in Japan or F344 strains. Among 27 SSLP loci, twenty-three (85%) were fixed in the Slc:Wistar rats, which was the highest among other Wistar stocks. The fixed 23 loci showed identical genotypes with those of F344 rats. Even in the unfixed loci, the predominant allele types, of which allele frequencies reached about 80 %, were identical with those of F344 rats. By adding the nine genetic variations examined previously, a total of 32 (89%) out of 36 loci were fixed and identical between the Slc:Wistar and F344 rats. These findings indicated the low genetic variation of the Slc:Wistar rats and the high genetic similarity between the Slc:Wistar and F344 inbred rats. Probably, the seed stock might have very similar genetic background with F344 rats and has been transferred as Wistar outbred rats. This study demonstrates the importance of the characterization of outbred rats and makes us pay ample attention to the genetic characteristics of the Slc:Wistar rats for the proper use of them. Chapter 2 The Zucker fatty (ZF) rat is an outbred rat and a well-known model of obesity without diabetes, harboring a missense mutation (fatty, abbreviated as fa) in the leptin receptor gene (Lepr). Slc:Zucker (Slc:ZF) outbred rats exhibit obesity while Hos:ZFDM-Leprfa (Hos:ZFDM) outbred rats exhibit obesity and type 2 diabetes. Both outbred rats have been derived from an outbred ZF rat colony maintained at the Tokyo Medical University. So far, genetic profiles of these outbred rats remain unknown. Here, we applied a simple genotyping method using Ampdirect reagents and FTA cards (Amp-FTA) in combination with simple sequence length polymorphisms (SSLP) markers to determine genetic profiles of Slc:ZF and Hos:ZFDM rats. Among 27 SSLP marker loci, 24 loci (89%) were fixed for specific alleles at each locus in Slc:ZF rats and 26 loci (96%) were fixed in Hos:ZFDM rats, respectively. This indicates the low genetic heterogeneity in both colonies of outbred rats. Nine loci (33 %) showed different alleles between the two outbred rats, suggesting considerably different genetic profiles between the two outbred rats in spite of their same origin. Additional analysis using 72 SSLP markers further supported these results and clarified the profiles in detail. This study revealed that genetic profiles of the Slc:ZF and Hos:ZFDM outbred rats are different for about 30% of the SSLP marker loci, which is the underlying basis for the phenotypic difference between the two outbred rats.Chapter 3 To develop a simple genotyping method, the Amp-FTA method has been developed by combining the advantages of the Ampdirect Plus and FTA card. This method allowed the direct PCR amplification of DNA from unpurified blood immobilized on the FTA card. PCR templates were prepared only by punching out the disc from the FTA card, which lead to a foolproof way of genotyping. The PCR products obtained were subjected to downstream analyses such as restriction enzyme treatment and direct sequencing. The Amp-FTA method was applicable to buccal swabs collected by simple technique minimizing distress to animals. Therefore, the Amp-FTA method is ideal for the genotyping and genetic monitoring of laboratory rats. This study clarified genetic characteristics of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats and further developed a simple genotyping method for genetic monitoring of the rat. In conclusion, this study demonstrated the importance of paying ample attention to genetic characteristics of rats for their proper use.

元資料の権利情報 : 本論文の一部は以下のとおり公表されている。(Part of this dissertation has been published as follows.) 1.Nakanishi, S., Serikawa, T., Kuramoto, T. 2015. Slc:Wistar outbred rats show close genetic similarity with F344 inbred rats. Experimental Animals 64 :25-29.2.Nakanishi, S., Kuramoto, T., Kashiwazaki, N., Yokoi, N. 2016. Genetic profiling of two phenotypically distinct outbred rats derived from a colony of the Zucker fatty rats maintained at the Tokyo Medical University. Experimental Animals 66:91-98.3.Nakanishi, S., Kuramoto, T., Serikawa, T. 2009. Simple genotyping method using Ampdirect® Plus and FTA® technologies: application to the identification of transgenic animals and their routine genetic monitoring. Laboratory Animal Resarch 25(1) :75-78.

各種コード

NII論文ID(NAID)

500001051301

NII著者ID(NRID)
  • 8000001166578
本文言語コード

jpn

データ提供元

機関リポジトリ / NDLデジタルコレクション

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